¿Es posible mejorar las tasas de fecundación cuando hacemos ICSI? Aspectos prácticos para cualquier laboratorio.

Is it possible to improve fertilization rates (FR) after the intra cytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique?

Autores: 

  • Mercedes Pascual,
  • Virginia Ferracuti,
  • María Florencia Veiga,
  • Dara Dobler,
  • Ana María Biagini,
  • Claudia Torres,
  • Santiago Giordana,
  • Fernando Neuspiller.

Institución: IVI Buenos Aires, Capital Federal, Buenos Aires, Argentina

RESUMEN

¿Es posible mejorar las tasas de fecundación (TF) luego de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)?

Es posible, analizando y modificando el protocolo de ICSI.

Dentro del laboratorio de fertilización in vitro, gametas y embriones son expuestos inevitablemente a fluctuaciones en las condiciones de cultivo, lo cual impacta negativamente sobre los procesos celulares. Cualquier modificación que estabilice estas variaciones debería afectar positivamente sobre los resultados.

Estudio retrospectivo que compara las TF de 483 casos del primer semestre de 2018 contra 466 del primer semestre de 2019, luego algunos cambios en el protocolo de la técnica de ICSI.

Se incluyeron los ciclos de ICSI realizados entre el 01/01/2018 y el 30/06/2018 y entre el 01/01/2019 y el 30/06/2019. En 2018 fueron 374 casos con ovocitos propios (P18) y 109 de ovodonación (O18) y en 2019 370 casos de propios (P19) y 96 de ovodonación (O19). Se obtuvo la TF por paciente, considerando aquellos cigotos con 2 pronúcleos sobre el total de ovocitos maduros microinyectados. Luego se calculó la TF promedio por grupo (O18, P18, O19 y P19) y por embriólogo. Las modificaciones abarcaron al medio de inyección, al aceite mineral y al tiempo de los ovocitos fuera del incubador. Además, incorporamos indicadores diarios de TF dentro al programa de control de calidad.

La TF promedio aumentó de manera significativa en los ciclos de propios (72,86% a 77,73%; p<0,05) y de ovodonación (75,27% a 81,27%; p<0,05). A su vez, todos los embriólogos registraron aumentos en sus TF.

Al ser un estudio retrospectivo y al haber aplicado los cambios en simultáneo, no podemos cuantificar la contribución individual de cada uno de ellos al aumento en la TF.

Es posible mejorar las TF sin necesidad de cambios costosos. Este trabajo describe intervenciones sencillas al alcance de un gran porcentaje de laboratorios a nivel mundial.

Palabras clave: Cigoto; Fertilización In Vitro; Inyecciones de Esperma Intracitoplasmáticas; Control de Calidad

SUMMARY
Is it possible to improve fertilization rates (FR) after the intra cytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique?
It is possible, after analyzing and modifying the ICSI protocol.
The work within the in vitro fertilization laboratory implies an inevitable exposure of gametes and embryos to fluctuations in culture conditions, which negatively affects cellular processes. Any modification that aims to stabilize these variations is expected to positively impact the results.
Retrospective study that compares the FR of 483 cases in the first half of 2018 against 466 in the first half of 2019, after the modification of the ICSI protocol.
ICSI cycles performed between 01/01/2018 until 06/30/2018 and between 01/01/2019 until 06/30/2019 were included. Year 2018 encompassed 374 cases with standard patients (S18) and 109 of ovodonation (O18), while 2019 included 370 cases of standard patients (S19) and 96 ovodonation (O19). The FR was obtained for each patient, considering the number of zygotes with 2 pronuclei over the total of mature oocytes microinjected. The average FR was then calculated by group (O18, S18, O19 and S19) and by embryologist. The modifications involved the injection medium, mineral oil and the time of the oocytes outside the incubator. In addition, we incorporated the use of daily FR indicators into our quality control program.
The average FR increased significantly in standard and ovodonation cycles (72.86% to 77.73% and 75.27% to 81.27% respectively; p< 0,05). In turn all embryologists recorded increases.
Being a retrospective study and having applied the changes in simultaneous, we cannot quantify the individual contribution of each of them to the increase in the FR
It is possible to improve FR without the need for drastic or costly changes. This work describes simple interventions available to a large percentage of laboratories worldwide.
Keywords: Zygote; Fertilization in Vitro; Sperm Injections; Quality Control

INTRODUCCIÓN
La tasa de fecundación (TF) es el parámetro que mide el éxito de la técnica de inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI). Se calcula haciendo la razón entre el número de cigotos que, aproximadamente 17 hs post inyección, exhiben 2 pronúcleos (PN) y 2 cuerpos polares (CP) sobre el número total de ovocitos maduros microinyectados (1; 2).
En el año 2017 la TF fue seleccionada como uno de los indicadores clave de performance (KPI, por sus siglas en inglés, Key Performance Indicator) de las prácticas de laboratorio (3), ya que es una medida objetiva de la calidad de las gametas que maneja el laboratorio como así también, las habilidades del operador, cobrando así particular relevancia dentro de los programas de gestión de calidad (4). Como todo KPI, la TF debe tener sus correspondientes valores de referencia: un valor mínimo aceptable y un valor objetivo a alcanzar. Tradicionalmente, estos valores variaban entre 60% y 80% y entre 70% y 100% respectivamente, pero no existía un consenso internacional sobre un valor único. Fue recién en 2017, cuando la TF fue seleccionada como KPI, que se definieron sus valores de competencia y referencia. Estos se establecieron en 65% y 80% respectivamente (3).
Es importante hacer un monitoreo continuo y sistemático de las TF e introducir mejoras en el caso que no se alcance el valor mínimo, dado que los pacientes tendrán más posibilidades de éxito en un laboratorio con altas tasas y porque este valor es un indicador del correcto funcionamiento del laboratorio. Teniendo esto en cuenta y frente a la actualización en los valores, en IVI Buenos Aires nos planteamos revisar nuestras TF, las cuales si bien se encontraban por encima del 70% no siempre alcanzaban el 75%. Es por ello que nos propusimos mejorar nuestros resultados, para lo cual analizamos los protocolos diarios de trabajo y diseñamos una serie de reformas. El objetivo que tiene este trabajo es analizar el impacto de una serie de cambios metodológicos introducidos en el laboratorio de reproducción asistida de alta complejidad sobre las tasas de fecundación.

MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño metodológico
Se compararon retrospectivamente las TF de todos los ciclos de ICSI realizados desde el 01/01/2018 hasta el 30/06/2018 y desde el 01/01/2019 hasta el 30/06/2019, a excepción de aquellos ciclos de pacientes que realizaron más de un intento, para los cuales se tuvo en cuenta solo el primero. Dentro del año 2018 se incluyeron 374 casos con ovocitos propios y 109 de ovodonación, con una edad promedio de pacientes de 36,81 ± 3,81 y de donantes de 25,17 ± 3,69. Mientras que dentro del año 2019 fueron 370 casos de propios y 96 de ovodonación, con las siguientes edades medias respectivamente: 37,40 ± 3,83 y 24,53 ± 3,47.

Estimulación ovárica
La estimulación ovárica controlada comenzó entre el primer y quinto día del ciclo, luego de una ecografía transvaginal, con la administración de 150 UI/día de FSHr + 75 UI/día de LHr (Pergoveris, Merck). La inhibición pituitaria se realizó con 0,25 mg/día de antagonistas de GnRH (Cetrotide, Merck). La ovulación se desencadenó con la combinación de 1500 UI de hCG (Ovidrel, Merck) y 0,2 mg de agonistas de GnRH (Gonapeptyl daily, Ferring) cuando había 3 o más folículos de mínimo 18 mm en diámetro.

Aspiración folicular e ICSI
Las aspiraciones foliculares se realizaron 36hs luego de la inducción de la ovulación. Los complejos ovocito-cumulus (COCs) fueron lavados exhaustivamente en Global Total HEPES (LifeGlobal) y transferidos posteriormente a placas con gotas de Global Total for Fertilization (LifeGlobal) cubiertas con aceite mineral (Irvine).
Los ovocitos fueron denudados mecánica y enzimáticamente 3 hs luego de la aspiración en aquellos casos en los que se utilizaron en fresco y a las 2 hs aquellos que debían vitrificarse.
La vitrificación y desvitrificación se realizó según el protocolo de Kitazato, utilizando dichos medios.
Los ovocitos desvitrificados se micro-inyectaron 2 hs post descongelamiento y los frescos transcurridas 4 hs de la aspiración.
La técnica de ICSI se realizó en un microscopio invertido (Olympus) a 40X. Una vez terminado el procedimiento, los ovocitos se transfirieron a gotas de Global Total (LifeGlobal) cubiertas por aceite mineral (Irvine).
La evaluación de la fecundación se realizó aproximadamente 17 hs luego de la inyección.
Todos los COCs, ovocitos denunados y micro-inyectados se cultivaron en incubadoras de mesada (Cook) a 37ºC con 5% O2 y 6% CO2, excepto al momento de la micro-inyección, cuando las placas que no estaban en uso permanecieron en incubadoras HeraCell (Thermo Fischer).

Protocolo de micro-inyección.
Durante el periodo de tiempo transcurrido entre julio y diciembre de 2018 se aplicaron cambios en los siguientes aspectos del protocolo de la técnica de ICSI: a) Momento de preparación de las placas de inyección. b) Modelo de placa utilizada c) Cantidad empleada de aceite mineral (Este punto fue factible gracias al cambio de modelo de placas). d) Tiempo de gaseo y atemperado del aceite y del medio de inyección. e) Lugar de mantenimiento de las placas que no estuvieran en uso. f) Número máximo de ovocitos a inyectar en cada placa. g) Tiempos de inyección: Se estableció un tiempo máximo desde que la placa sale del incubador hasta que se guarda nuevamente. En la tabla 1 se muestra una comparativa detallada entre el protocolo del año 2018 y del año 2019.
Además, incorporamos indicadores diarios de TF, los cuales debían ser completados todos los días con los valores de las tasas de cada embriólogo. Estos indicadores han de encontrarse fácilmente a la vista dentro del laboratorio, permitiendo visualizar rápidamente si algún embriólogo comienza a mostrar una caída en sus resultados.

Variables analizadas
Para cada paciente se obtuvo la TF, considerando el número de cigotos con 2 PN y 2CP sobre el total de ovocitos maduros microinyectados. Luego se calcularon las TF promedio para los ciclos de propios y ovodonación de 2018 y de 2019 y la TF de cada embriólogo.

Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante el test de t-Student con el software IBM SPSS Stadistics. Se consideraron significativos aquellos valores de p menores a 0,05.

RESULTADOS
La TF promedio aumentó de manera significativa tanto en los ciclos de propios (72,86% vs 77,73%; p<0,05) como en los ciclos de ovodonación (75,27% al 81,27%; p <0,05) (Tabla 2).
A su vez, los tres embriólogos incluidos en este estudio también registraron aumentos en sus TF. Estos resultaron significativos para dos de ellos (emb#1: 73,45% vs 75,66%; p=0,5; emb#2: 75,47% vs 82,59%; p<0,05; emb#3: 72,58% vs 79,94%; p<0,05).

DISCUSIÓN
El conjunto de modificaciones introducidas impactan positivamente sobre las tasas de fecundación. Teniendo en cuenta que se trata de un estudio retrospectivo, no podemos cuantificar la contribución individual de cada cambio. Aun así, hipotetizamos que el aumento se debe a una suma de variables que en conjunto redundan en un menor tiempo de los ovocitos fuera del incubador, expuestos a la luz y sujetos a variaciones en parámetros físico químicos en la placa de micro-inyección.
Dentro del cuerpo humano, los posibles cambios en osmolaridad, pH y temperatura suceden de manera gradual, a diferencia del laboratorio, donde pueden ser grandes y rápidos, por lo que no hay duda que las condiciones del cultivo impactan sobre las gametas y embriones (5). Esto se explica en parte por que la división celular y la segregación de los cromosomas dependen principalmente de una estructura dinámica como es el huso meiótico. Cualquier manipulación que lo altere, eventualmente afectará estos procesos. A pesar de los esfuerzos por mantener estables las condiciones en de las placas de cultivo, no es errado pensar que pueden existir fluctuaciones, aunque sea de manera transitoria, cuyo impacto dependerá de la duración y magnitud de las mismas.
La exposición de ovocitos humanos a temperatura ambiente produce cambios en la organización del huso meiótico. Estos incluyen disminución en su tamaño, disrupción del patrón de microtúbulos o incluso ausencia total de los mismos. Dependiendo del tiempo de exposición también se ve afectada la ubicación de los cromosomas en la placa metafásica (6,7). Incluso la exposición de ovocitos sin denudar a bajas temperaturas impacta de manera negativa en elementos del retículo endoplasmático, aparato de Golgi, mitocondrias y citosol (8). El restablecimiento de la temperatura a 37°C no siempre restaura la morfología original, sino que la capacidad de un ovocito de volver a ensamblar su huso meiótico es tiempo y temperatura dependiente (6,9). Un control térmico riguroso permite estabilizar el huso meiótico y aumentar las tasas de fertilización y de embarazo frente a los sistemas tradicionales, en donde los ovocitos se enfrían a 33-34°C al ponerlos en la platina, incluso si la placa se encuentra previamente calentada (10). Sin embargo, este control riguroso se logra mediante el uso de cubreobjetos termostatizados y calentadores de objetivos, algo que no está al alcance de cualquier laboratorio. En este punto, creemos que el control de la temperatura se puede conseguir, aunque no de forma tan exacta, con cambios como los que mencionamos en este trabajo: el uso de medios atemperados y gaseados desde el día previo, el empleo de un mayor volumen de aceite mineral, la preparación de placas con suficiente anticipación y el cambio de la platina calefactada por el incubador para su mantenimiento cuando no están en uso, son medidas que disminuyen la probabilidad de variaciones en la temperatura.
Si tenemos presente que la integridad del huso meiótico es crítica para la alineación de los cromosomas y su correcta segregación en el proceso de fertilización, y que anomalías en el citoesqueleto pueden dar lugar a aneuploidias o poliploidías, los cambios en la temperatura podrían impactar en la cantidad de cigotos fecundados con un número anormal de pronúcleos. Al calcular la tasa de fecundación teniendo en cuenta solo aquellos cigotos con 2PN, se excluyen los poliploides y dado que nuestros resultados son altos, se desprende que el porcentaje de cigotos con varios pronúcleos es bajo, reforzando la idea que la temperatura se mantiene más estable.
Teniendo esto en cuenta, se puede pensar en un concepto de aneuploidias inducidas de manera iatrogénica, es decir, aberraciones que podrían surgir en cualquier punto del manejo de gametas y embriones. En ese sentido, el momento de la microinyección sería clave, ya que es el momento en el que los ovocitos pasan el mayor tiempo fuera del incubador. Hay estudios en ovocitos de donantes como población control que muestran que las tasas de embriones euploides varían entre diferentes centros hasta en un 40% (11). Si bien no se conoce si estas diferencias se deben a errores en la meiosis o en la mitosis, en caso que fueran errores de naturaleza mitótica, habría que prestar especial atención al laboratorio de FIV y sus condiciones. Los embriones resultantes en estos casos no serían aneuploides en su totalidad, sino mosaicos. Es conocido ya el hecho de que el mosaicisimo ocurre más frecuentemente en embriones de ratón cultivados in vitro que aquellos que crecen in vivo (12). De esto se desprende que resulta crucial intentar mantener constante la temperatura durante todos los eventos que transcurren dentro del laboratorio y que de realizarse cambios con este objetivo, pueden tener implicancias más allá de un aumento en las tasas de fecundación.
El pH de los medios de cultivo es otro motivo de especial atención. El mismo está determinado principalmente por la concentración de bicarbonato en los medios y el porcentaje de CO2 en el incubador. Tradicionalmente, durante la técnica ICSI se han empleado medios con N-hidroxietilpiperazina-N-etanosulfonato (HEPES) como amortiguador de pH, ya que si la inyección se demora el mismo puede fluctuar. Incluso hay evidencia que sugiere que los ovocitos durante la meiosis carecen de una regulación robusta del pH (13), apoyando aún más el uso de un amortiguador en el medio. Sin embargo, hay trabajos que reportan efectos negativos de este compuesto sobre las gametas en varios modelos animales (14,15), sobre todo cuando el mismo es micro-inyectado dentro de los ovocitos (16), ya que inhibe la reiniciación de la meiosis. En cultivos de líneas celulares que incluían este compuesto, la exposición a la luz aumentó la presencia de productos citotóxicos capaces de inhibir la proliferación (17). También en humanos, el uso del HEPES ha resultado perjudicial: ovocitos microinyectados en este medio exhiben tasas significativamente mayores de degeneración y de cigotos tripronucleados y tasas significativamente menores de embarazo e implantación al compararlos con ovocitos inyectados en medio sin HEPES (18). En este punto, el cambio hacia un medio de microinyección sin amortiguador puede haber impactado positivamente. No solo porque se evita el uso del HEPES, sino también porque esta modificación trae aparejada una mayor consciencia del tiempo empleado para micro-inyectar. De alguna manera, nos obligó a trabajar con rapidez para evitar el cambio en el pH y a su vez, ayudó a alcanzar el objetivo de micro-inyectar una placa en menos de 5 minutos. Esto a su vez, es ventajoso ya que se minimizan las perturbaciones externas en general. Haber disminuido la cantidad de ovocitos a trabajar a un máximo de 3 por placa también contribuyó a alcanzar esta meta.
Otro factor a tener en cuenta en la manipulación de gametas es la exposición a la luz. La misma puede resultar perjudicial para la viabilidad in vitro, teniendo en cuenta que los procesos a nivel fisiológico transcurren a oscuras. Si bien, no hay datos concluyentes que indican que la luz es dañina para los ovocitos y embriones humanos, hay suficiente evidencia que afecta a otras especies de mamíferos: existen estudios que han revelado que durante la manipulación in vitro la luz es causante de estrés. Se registran efectos deletéreos sobre la proliferación celular y el desarrollo embrionario al estadio de blastocisto, con aumentos en la expresión del gen de Hsp70 y producción de especies reactivas de oxígeno (19,20) respuestas celulares clásicas al estrés ambiental. Aunque falten datos sobre el efecto de la luz en los embriones humanos, es prudente tomar las medidas adecuadas para minimizar los posibles efectos nocivos, sobre todo porque también se desconoce si las gametas y embriones tienen un sistema de protección para la luz. Un componente importante y a menudo pasado por alto sobre el cual también impacta la luz es el aceite mineral. Su composición puede verse adulterada tras la exposición a la luz porque se forman peróxidos, lo que resulta en la transferencia de contaminantes hidrosolubles hacia el medio de cultivo (21; 22). Como se discute previamente, el hecho de haber mantenido las placas dentro del incubador en todo momento, haberlas sacado solo para micro inyectar y haber procurado hacerlo lo más rápido posible, hizo que se redujera drásticamente el tiempo que el aceite mineral fue expuesto a la luz, mientras que el hecho de haber micro-inyectado en menos tiempo redujo el tiempo de exposición de los ovocitos.
Finalmente, destacamos el uso de indicadores diarios de fecundación. El control de calidad interno es el paso inicial para implementar un sistema de gestión de calidad y constituye una herramienta para detectar el cumplimiento de los objetivos establecidos y en caso de errores, permite corregirlos y así garantizar la fiabilidad de los resultados (23; 24; 25). Si bien en IVI Buenos Aires implementábamos ya los indicadores mensuales y trimestrales como parte del programa de gestión de calidad, el uso de indicadores diarios dentro del laboratorio fue un gran recurso para los embriólogos, ya que permitía visualizar en tiempo real los resultados. De esta forma se detecta a tiempo una caída en las tasas, pudiendo revisar posibles causas en el momento y tomar medidas inmediatas con el objetivo de revertirla. Los indicadores mensuales y trimestrales, en cambio, son menos dinámicos y si bien también detectan alarmas, no permiten tomar acciones en tiempos tan cortos como los indicadores diarios y evitar así bajas sostenidas.
Por último, es interesante recalcar que al seleccionar la TF como KPI, se menciona que es importante definir una población de referencia para su cálculo y se sugiere excluir aquellos casos en los que se anticipa una baja de fecundación, como puede ser el caso de biopsias testiculares o factores masculinos severos (3). En este trabajo, dichos casos fueron incluidos y aun así obtuvimos excelentes resultados.

CONCLUSIÓN
Es posible mejorar las tasas de fecundación sin necesidad de realizar cambios drásticos ni costosos, como puede ser la adquisición de nuevos modelos de incubadores, cubreobjetos termostatizados y calentadores de objetivos. En cambio, las modificaciones aquí descriptas son intervenciones sencillas que pueden alcanzar a un gran porcentaje de laboratorios a nivel mundial y cobran especial relevancia para aquellos pequeños que no cuentan con la última tecnología ni gran capacidad de inversión. Sólo se necesita analizar en detalle los protocolos en uso, introducir las mejoras que se crean necesarias, normalizar las prácticas entre operadores y tomar la determinación de monitorear los resultados.

Agradecimientos:
A la Dra. Natalia Basile por su revisión critica y aportes.

REFERENCIAS

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