Cultivo ciego y su mejora en las tasas de blastocistos utilizables.

Blind culture and its improvement in usable blastocyst rates.

Autores:

  • Marinés Carbonaro, 
  • Karina Lucrecia Calvo,
  • Mariana Andrea Pérez,
  • Claudia Beatriz Brignardello,
  • Carla Cintia López.
  • Diego César Iglesias
  • Leticia Solari,
  • Carlos Alberto Morente.

Institución: Centro Médico PROAR – Rosario. Santa Fe, Argentina
Mail de contacto: mcarbonaro@proar.com.ar

RESUMEN
¿Mejoran las tasas de embarazo y de Blastocistos utilizables (transferidos más vitrificados) cuando los embriones son cultivados de forma continua sin retirarlos de la incubadora hasta el día de la transferencia?
Minimizar la observación de los embriones mejora la tasa de Blastocistos utilizables, contando con más embriones para vitrificar, sin modificar la tasa de embarazo.
La evaluación del desarrollo embrionario requiere que se retiren los embriones del microambiente controlado de la incubadora y se evalúen en el microscopio, exponiendo los embriones a fluctuaciones de temperatura y pH que pueden tener un efecto negativo en el desarrollo, en particular en la formación de Blastocistos.
Diseño: estudio retrospectivo descriptivo de corte transversal. Se analizaron 219 pacientes que realizaron ICSI o FIV de enero a junio de 2019 con cultivo a Blastocisto.
Materiales y Métodos: 219 pacientes se dividieron en dos grupos Grupo 1: cultivos que fueron retirados del incubador luego de la fertilización al menos una vez antes de día 5 (cultivo convencional) y Grupo 2: cultivos en los que luego de evaluar fertilización no fueron retirados del incubador hasta día 5 (cultivo ciego).
Resultados: no hubo diferencias entre ambos grupos según edad, número de ovocitos inseminados, número de ovocitos fertilizados y tasa de fertilización. El grupo 2 presentó mayor tasa de blastocistos y mayor número promedio de embriones congelados respecto al grupo 1, sin evidenciar variación en la tasa de embarazo.
Se necesitaría sumar mayor cantidad de casos y evaluar la tasa de embarazo por paciente para hacer más robusto este estudio.
Este hallazgo coincide con la literatura e incentiva a que los cultivos a Blastocisto no sean retirados de su microambiente controlado hasta el día de la transferencia.
Palabras clave: Embriología, Desarrollo embrionario, Blastocisto, Temperatura, pH, Reproducción.

ABSTRACT
Can clinical pregnancy rate and usable blastocysts (transfer + vitrified) be improved when embryos are cultured continuously without removing them from the incubator until the transfer day?
Blastocysts formation is enhanced upon decreasing the frequency of embryo inspection outside the incubator, so more embryos are available to be vitrified; although there were no significant differences in pregnancy rate.
Embryos are examined microscopically every morning to assess embryo development; consequently, the frequent exposure to non-optimal conditions outside the incubator may adversely affect embryonic development, particularly blastocyst formation.
Study design : descriptive retrospective cross-sectional study. From January to June 2019 a total of 219 ICSI/FIV patients were included in this study.
Materials and Methods: 219 patients were divided into two groups. Group 1: the embryos in this group were observed outside the incubator after insemination at least once before transfer day (conventional culture) and Group 2: embryos were observed only to assess fertilization and were not removed from the incubator until day 5 (blinded culture).
Results: the mean age, the number of injected and fertilized oocytes and fertilization rate were not statistically different between groups. In group 2 the number of blastocysts was increased and the number of cryopreserved blastocysts was higher than in group 1. No significant differences in the clinical pregnancy rate were observed between the two groups.
Although more patients should be included to confirm the conclusions, it must be noted that the higher number of cryopreserved blastocysts within the experimental group could possibly lead to a higher cumulative clinical pregnancy rate.
Our results are in concordance with the literature and further efforts should be done in order to not disturb the embryo environment until the transfer day.
Keywords: embryology, embryo development, blastocysts, temperature, pH, reproduction

INTRODUCCIÓN
Aunque se ha investigado mucho sobre el metabolismo y cultivo embrionario, todavía no se sabe a ciencia cierta lo que el embrión necesita para sustentar un metabolismo óptimo in vitro. Sin embargo, la adaptación a condiciones de cultivo subóptimas da como resultado un metabolismo embrionario alterado, por lo tanto, es esencial que las condiciones de cultivo embrionario se adecuen a la fisiología normal del embrión para evitar el estrés adaptativo (1,2).
Para evaluar el desarrollo embrionario en el laboratorio, las observaciones instantáneas requieren que se retiren los embriones del microambiente controlado de la incubadora y se evalúen en el microscopio, esto implica la exposición de los embriones a fluctuaciones de temperatura y pH que pueden tener un efecto negativo en el desarrollo, en particular en la formación de Blastocistos
Si bien los embriones tienen plasticidad de desarrollo y pueden adaptarse a su entorno, a veces los cambios que el embrión debe afrontar tiene un alto costo. El exceso de adaptación puede comprometer la viabilidad del embrión, su criotolerancia, el mantenimiento del embarazo, el crecimiento fetal y la salud de la descendencia (3).
Hay numerosas variables que influyen en el desarrollo embrionario, entre ellas se encuentran el pH, las concentraciones de Co2 y O2, la temperatura, humedad, las exposiciones a la luz, especies oxígeno reactivas (ROS) y los medios de cultivo.
El mantenimiento de las condiciones de pH interno (pHi) es fundamental para la supervivencia y desarrollo del embrión. Pequeñas desviaciones por períodos cortos pueden tener un impacto dramático. Se observó que subiendo ligeramente el pH 0,15 unidades por 4 horas se afectaba significativamente el metabolismo embrionario (4).
Los embriones tempranos tienen una capacidad limitada para regular el pH interno y se encuentran por lo tanto a merced del pH externo para el control de su pH. Típicamente, los embriones tempranos requieren un pH ligeramente inferior antes de la activación del genoma, aunque la diferencia es fisiológicamente pequeña. Debido a la sensibilidad de los embriones al pH, es esencial para la calidad del embrión que se equilibren correctamente los medios de cultivo (4).
La minimización de las aperturas de las puertas de la incubadora mejora la estabilización del pH.
La temperatura es otro parámetro fundamental y debe ser monitoreado cuidadosamente como parte de un programa integral de control de calidad. La apertura de la puerta para retirar una placa reduce la temperatura del interior de la incubadora, por lo tanto, el número de apertura de puertas y el ancho de apertura son dos factores que deben ser minimizados. Una vez fuera de la incubadora, las placas que contienen embriones deben mantenerse a temperatura controlada por que se enfrían rápidamente, además hay pérdida de calor entre la platina térmica y la placa de cultivo, lo cual es perjudicial para el desarrollo embrionario (1).
Las ROS pueden perjudicar el desarrollo embrionario in vitro. Su formación se acelera a través de la utilización de niveles atmosféricos de oxígeno. El exceso de exposición a la luz, presencia de iones de metales pesados en el cultivo o deficiencias de los medios de cultivo pueden generar la formación de ROS (5).
Los peróxidos se forman a partir de la oxidación de los dobles enlaces dentro del propio aceite, la exposición a la luz o al calor pueden formar peróxidos causando algún efecto negativo en el desarrollo embrionario (6,7).
La clasificación morfológica tradicional de embriones requiere una interrupción repetida del microambiente de la incubadora al sacarlos y observarlos al microscopio por lo que se planteó en nuestro laboratorio evaluar si los pacientes que realizaron Cultivo ciego (cultivo ininterrumpido en un entorno estable) tienen mayores tasas de blastocistos utilizables (transferidos más vitrificados) y tasas de embarazo que aquellos con cultivo convencional.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio retrospectivo descriptivo de corte transversal. Se analizaron 219 pacientes de enero a junio de 2019 en Centro Médico PROAR. Se incluyeron aquellos casos que realizaron ICSI o FIV con cultivo a blastocisto. Fueron excluidas del estudio las pacientes que transfirieron en día 3 y dejaron el resto de los embriones en cultivo a día 5.
Los embriones fueron incubados en gotas de 30ul de medio de cultivo continuo (CSC Irvine) de a 1 ó 2 embriones por gota. Se utilizaron incubadoras tri gas K-systems (G185 y G210), a 37°C, y con 5% O2 y 6% CO2.
Se compararon 2 grupos, Grupo 1: cultivos que fueron retirados del incubador luego de la fertilización al menos una vez antes de día 5 (cultivo convencional) y Grupo 2: cultivos en los que luego de evaluar fertilización no fueron retirados del incubador hasta día 5 (cultivo ciego). Las variables cuantitativas se analizaron mediante test de Student o U Mann Whitney, mientras que las categóricas por test de Fisher, p<0,05.

RESULTADOS 
Los grupos fueron comparables en edad, número de ovocitos fertilizados e inseminados y cantidad de embriones transferidos (Tabla 1). El grupo 2 presentó mayor tasa de blastocistos y mayor número promedio de embriones congelados respecto al grupo 1 (Tabla 1, Figura 1).

Tabla 1: Tabla de resultados. Grupo 1: cultivo convencional y Grupo 2: cultivo ciego.

Figura 1: Tasa de blastocistos. Grupo 1: cultivo convencional y Grupo 2: cultivo ciego.

No hubo diferencias en las tasas de embarazo clínico o implantación (Tabla 1, Figura 2).

Figura 2: Tasas de embarazos. Grupo 1: cultivo convencional y Grupo 2: cultivo ciego.

Discusión:
Un estudio de Zhang J y col (8) describió los efectos de reducir la frecuencia de las observaciones de los embriones fuera de la incubadora. Los resultados mostraron un aumento significativo en el desarrollo de los Blastocistos al día 5 junto con un aumento significativo de blastocistos de buena calidad y Blastocistos aptos para congelamiento. Por lo tanto, simplemente con reducir la observación microscópica el desarrollo del embrión a Blastocisto logró mejores resultados.
Con respecto a los dispositivos de lapsos de tiempo, como el Time lapse la cantidad total calculada de exposición a la luz para los embriones en dispositivos de lapsos de tiempo es menor que la que comúnmente se utiliza en la micromanipulación y evaluación tradicional de embriones. Rubio I y col (9), compara un grupo control en incubadoras convencionales con el grupo en estudio TMS (Time lapse), se observa un porcentaje estadísticamente significativo mayor de embriones óptimos en día 3 y día 5 para el grupo TMS vs el grupo control.
El cultivo ininterrumpido en nuestras condiciones de trabajo permitió obtener un 22% más de Blastocistos utilizables con un consecuente incremento en el número de embriones vitrificados, también se observó un 27% más de Blastocistos expandidos. No pudimos encontrar una mejora en la tasa de embarazo por transferencia en fresco aunque no determinamos la tasa de embarazo acumulativa.
El cultivo ciego parece ser beneficioso ya que se asemeja a las condiciones fisiológicas, no exponiendo a los embriones a cambios bruscos de pH, temperatura y luz. Esta medida es simple de realizar no implicando gastos económicos extra ni de infraestructura con lo cual cualquier laboratorio de Embriología lo podría implementar.
Para hacer más robusto este estudio se necesitaría sumar mayor cantidad de casos y evaluar la tasa de embarazo acumulativa por paciente.
La selección del embrión más apto sin llegar a métodos invasivos, para ser transferido al útero sigue siendo un desafío en los laboratorios de FIV
Le corresponde a cada laboratorio determinar que protocolo se adapta mejor a la totalidad de su sistema de cultivo.

CONCLUSIÓN
En función de nuestra experiencia minimizar la observación de los embriones mejora la tasa de Blastocistos y aumenta el número de embriones vitrificados.

Agradecimientos
Los autores agradecen al equipo médico de PROAR por brindar soporte técnico y sugerencias valiosas para realizar este estudio.

REFERENCIAS

  1. Leese HJ1, Baumann CG, Brison DR, McEvoy TG, Sturmey RG. Metabolism of the viable mammalian embryo: quietness revisited. Mol Hum Reprod. 2008;14(12):667-72.
  2. Leese HJ, Sturmey RG, Baumann CG, McEvoy TG. Embryo viability and metabolism: obeying the quiet rules. Hum Reprod. 2007;22:3047–3050.
  3. Lane M, Gardner, DK. Embryo culture médium: which is the best?. Best practice and Research in Clinical Obstetrics and Gynaecology. 2007; 21: 83-100
  4. Lane M, Gardner, DK. Regulation of ionic homeostasis by mammalian embryos. Seminars in Reproductive Medicine 2000; 18: 195-204
  5. Combelles CM, Hennet ML. Media composition: antioxidants/chelators and cellular function. Methods Mol Biol. 2012;912:129-59.
  6. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K. Peroxidation of mineral oil used in droplet culture is detrimental to fertilization and embryo development. Fertil Steril. 2007;88(3):741-3.
  7. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K. Damage of embryo development caused by peroxidized mineral oil and its association with albumin in culture. Fertil Steril. 2009;91(5):1745-9
  8. Zhang J y col. Reduction in exposure of human embryos outside the incubator enhances embryo quality and blastulation. Reproductive BioMedicine OnLine 2010; 20, 510-515
  9. Rubio I. y col. Clinical validation of embryo culture and selection by morphokinetic analysis: a randomized, controlled trial of the EmbryoScope. Assisted Reproduction. 2014; vol 102 NO 5 1287-1294