Morfología embrionaria en estadios de clivaje: su valor predictivo en Día 5.

Embryonic morphology in stages of cleavage: its predictive value on day 5.

Autores:

  • Mariana Hernández,
  • Andrea Dematteis,
  • Anahí D’Agostino,
  • Camila Frautschi,
  • Gustavo Estofan.

Institución: CIGOR. Centro Integral de Ginecología, Obstetricia y Reproducción. Córdoba.

Mail de contacto:  mariana.hh@gmail.com

RESUMEN

Pregunta de estudio: ¿La evaluación de morfología embrionaria en días 2 y 3 puede mejorar la predicción de implantación de los blastocistos?

Respuesta resumida: La consideración de parámetros morfológicos de día 2 y 3 no mejora la predicción de implantación de la morfología de blastocistos.

Lo que ya se sabe: Al agrupar la morfología de diferentes estadios embrionarios tempranos se puede predecir la implantación. La combinación de morfología temprana y de blastocistos ha tenido resultados contradictorios: no predijo calidad de blastocistos y no mejoró la predicción de implantación.

Diseño del estudio: Prospectivo. Se incluyeron 598 ciclos realizados entre noviembre 2016 y diciembre 2018, de pacientes ≤38 años y receptoras de ovocitos. Se analizaron 1944 embriones y 277 transferencias de blastocisto único.

Materiales y Métodos: Los embriones se cultivaron individualmente y se evaluaron en días 2, 3, 5-6. Se analizó la relación entre nucleación en día 2 y número de células y morfología en día 3, con desarrollo y calidad de blastocistos en día 5-6. Se comparó la tasa de implantación de acuerdo a la calidad en días 2-3 y 5-6. Análisis estadístico mediante Chi-cuadrado.

Resultados: La morfología embrionaria en días 2 y 3 predijo significativamente detención del desarrollo, expansión y calidad de los blastocistos. La implantación de los blastocistos fue significativamente diferente según su calidad: ≥4BB o <4BB (63%, 32%; p<0.0001). La calidad embrionaria buena, regular o mala en días 2-3 no permitió distinguir una mejor o peor implantación en los grupos ≥4BB (63%, 63%, 63%, NS) y <4BB (34%, 37%, 28%, NS).

Limitaciones del estudio: N bajo. Condiciones de laboratorio variadas.

Implicancias de los hallazgos: Los resultados sugieren que no es necesario realizar evaluación temprana al seleccionar blastocistos.

Palabras clave: morfología embrionaria, blastocisto, implantación

SUMMARY
Study question: Can embryonic morphology evaluation on day 2 and 3 improve the prediction of blastocyst implantation?
Summary response: Day 2 and 3 morphological parameters consideration does not improve the prediction of blastocyst morphology implantation
What is already known: The combination of different embryonic stages morphology predicts implantation. The combination of day 2 and 3 and blastocyst morphology has shown contradictory results: it did not predict blastocyst quality and did not improve the prediction of implantation.
Study design: Prospective; 598 cycles performed between November 2016 and December 2018; patients ≤38 years and oocyte recipients were included; 1944 embryos and 277 single blastocyst transfers were analyzed.
Materials and methods: Embryos were individually cultured; morphology evaluation was performed on days 2, 3, 5-6. We analyzed the relationship between nucleation on day 2 and number of cells and morphology on day 3 with blastocyst development and quality on day 5-6. The implantation rate was analyzed according to embryo quality on days 2-3 and 5. Statistical analysis was performed using Chi-square test.
Main Results: Embryo morphology on days 2 and 3 predicted development arrest, expansion and quality of blastocysts. Blastocyst implantation was significantly different according to morphological quality ≥4BB or <4BB (63%, 32%; p<0.0001). A good, regular or bad embryonic quality on days 2-3 did not allow distinguishing a better or worse implantation in the groups ≥4BB (63%, 63%, 63%, NS) and <4BB (34%, 37%, 28%, NS).
Limitations: Low number of cases. Varied laboratory conditions.
Wider Implications of the findings: Results suggest that it is not necessary to perform early embryonic evaluation when selecting blastocysts.
Key words: embryo morphology, blastocyst, implantation.

INTRODUCCIÓN

Se han propuesto muchas estrategias para la selección de embriones viables en reproducción humana asistida a lo largo del tiempo.

Durante décadas, la técnica más empleada por los embriólogos fue la evaluación de la morfología embrionaria desde el día 1 de cultivo hasta el día 3, momento en el que los embriones se transferían o congelaban.

Determinados parámetros morfológicos se emplearon para predecir implantación y embarazo. Entre estos parámetros están: la morfología de pronúcleos en día 1 propuesta inicialmente por Tesarik y Greco, (1) el tiempo en el que ocurre el primer clivaje (2,3), la simetría y el número de blastómeras en días 2 y 3 (4) la fragmentación (5) y la multinucleación. (6)

Con la intención de realizar transferencias de un único embrión para disminuir la tasa de embarazos múltiples, se intentó identificar entre los embriones de la cohorte cual era un embrión de alta calidad (“top embryo”). Para ello se agruparon características embrionarias de diferentes estadios, que individualmente demostraron valor para predecir la implantación. Existen numerosos trabajos realizados en este sentido, que relacionan morfología de pronúcleos y clivaje temprano, (1) pronúcleos y morfología en día 3 (7,8) o morfología en día 2 y día 3 (9,10). Para Van Royen y cols, un embrión de alta calidad se caracterizó por la presencia de 4 o 5 blastómeros en el día 2 y al menos 7 blastómeros en el día 3, la ausencia de blastómeros multinucleados en día 2 y menos de 20% de fragmentos extracelulares en el día 2 y día 3. (9,10) Esta metodología de evaluación, requiere que los embriones sean observados más de una vez, y que se los cultive de manera individual.

Sin embargo, el éxito de la evaluación morfológica temprana ha sido limitado, ya que embriones de alta calidad a menudo no logran la implantación o no producen un nacimiento vivo, y aquellos con mala calidad a veces tienen éxito.

Con la introducción de medios secuenciales y la posibilidad de cultivar los embriones hasta el día 5 y 6, quedaron en evidencia aquellos embriones cuyo desarrollo se detiene antes de ser transferidos o congelados. (11) Además, la mayor sincronía entre el endometrio y este estadio embrionario aumenta las tasas de embarazo e implantación. (12,13,14,15) Esta mejora en la selección e implantación dio lugar a la tendencia creciente de trasferir un único blastocisto de buena calidad, disminuyendo el riesgo de embarazo múltiple. (15,16,17)

Para este estadio surgieron nuevos criterios de selección en base a la morfología del blastocisto, que tuvieron en cuenta el grado de expansión del blastocele y el desarrollo del trofoectodermo y de la masa celular interna.

Una escala de clasificación ampliamente difundida es la propuesta por Gardner y cols en el 2000. (15) A medida que se fue extendiendo el uso del cultivo a blastocito, se fue ampliando y/o modificando el criterio de Gardner, en variaciones tales como la “puntuación de calidad de blastocisto” (blastocyst quality score, BQS), (18) el criterio de ASEBIR (Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción) (19) y el propuesto por el Consenso de Estambul en 2011 entre otros. (20)

Numerosas investigaciones han mostrado una fuerte correlación entre los resultados clínicos (tasa de embarazo e implantación) y la clasificación morfológica del blastocisto. (15,21,22,23) Incluso algunos autores lograron relacionar la calidad del trofoectodermo con la tasa de implantación. (22,23,24)

Dos grupos de investigación han intentado incorporar la morfología de blastocisto a una propuesta de “top embryo”, agrupando la evaluación de características de estadios tempranos a la evaluación de día 5. Guerif F y cols utilizaron morfología de pronúcleos, clivaje temprano y morfología de día 2 de desarrollo, (27,28) mientras que Herbemont y cols utilizaron morfología de día 2 y 3, aunque no combinadas. (29) Ambos grupos encontraron que, en transferencias de blastocistos, la morfología temprana no pudo predecir la implantación, y al considerarla junto con la morfología en día 5 , no aumentó el valor de predicción de la selección de blastocistos.

El objetivo de este trabajo fue analizar si la evaluación morfológica de embriones tempranos en día 2 y 3 puede predecir el desarrollo y calidad de los blastocistos, y mejorar la predicción de su implantación.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño: Análisis prospectivo.

Población. Se incluyeron 598 ciclos de ICSI con ovocitos frescos, realizados por pacientes de hasta 38 años o receptoras de ovocitos, entre noviembre de 2016 y diciembre de 2018, en los que se realizó cultivo hasta día 5-6 de todos o de algunos de los embriones.

Se evaluó el desarrollo y calidad hasta día 6 de 1944 embriones que en día 2 de desarrollo presentaron 2 a 6 células y hasta 20% de fragmentos, y se analizó la tasa de implantación en 277 transferencias en fresco de un único blastocisto.

Cultivo embrionario. Los embriones se cultivaron de manera individual en microgotas de medios secuenciales bajo aceite (Vitrolife, Sage). Durante el cambio de medio en día 3 se respetó el orden de los embriones en las gotas de cultivo. Se usaron dos tipos de incubadoras: convencional y trigas (Thermo Scientific y K-system), ajustando el CO2 para cada medio de cultivo, para lograr un ph entre 7.2 y 7.3. El ICSI se realizó a las 5 horas post aspiración. Luego de 17 horas se evaluó la sobrevida y fertilización de los ovocitos.

Evaluación embrionaria

Día 2, evaluación de núcleos visibles. Realizada entre 41 y 43 horas de desarrollo. De acuerdo a los núcleos observados en las blastómeras, los embriones se clasificaron como:

    • Mononucleados (1N): todas las blastómeras mostraron un solo núcleo;
      • Multinucleados(#N) : al menos una blastómera tuvo dos o más núcleos;
  • Sin núcleos visibles (0N): Ninguna blastómera fue multinucleada, y al menos una blastómera no mostró núcleos visibles. Día 3, evaluación de desarrollo y calidad embrionaria. Realizada entre 65 y 67 horas de cultivo post ICSI. De acuerdo al desarrollo, los embriones se agruparon en: menos de 6 células, 6-7 células y 8 o más células. De acuerdo a la morfología, los embriones se agruparon como:

    • Buena calidad: células simétricas, menos de 10% de fragmentos extracitoplásmicos, no multinucleados en día 2;
    • Calidad regular: células asimétricas, 10% a 25% de fragmentos extracitoplásmicos;
    • Mala Calidad: células asimétricas, más de 25% de fragmentos extracitoplásmicos.

Día 5-6, evaluación de calidad y desarrollo de blastocisto. Realizada entre 117 y 144 horas de cultivo post ICSI, evaluada de acuerdo al criterio de Gardner13 en base a la expansión y eclosión del blastocisto, grados 1 a 6, la morfología de la Masa Celular Interna (MCI) y el Trofoectodermo (TE), en grados A, B y C.

Los blastocistos viables se transfirieron o fueron vitrificados.

Análisis de datos y estadística.

Relación entre parámetros morfológicos individuales de días 2 y 3 y de blastocistos. Los blastocistos se agruparon de acuerdo a:

  1. el desarrollo hasta día 5-6, en 4 categorías: detenidos (en día 5 o 6), o expandidos en día 5 hasta grados 1-2, grado 3 y grados 4-5-6 (n=1944 embriones).
  2. la morfología de MCI-TE en día 5-6, en 4 categorías: AA; AB o BA; BB; y Cx/xC (CA, CB, CC, BC, AC) (n=1111 blastocistos).

Se comparó la distribución de estas categorías de acuerdo a: (A) los núcleos visibles de las blastómeras en día 2, (B) el número de blastómeras en día 3, y (C) la calidad embrionaria en día 3.

Relación entre parámetros morfológicos agrupados de días 2 y 3 y de blastocistos. En 1565 embriones, se comparó el desarrollo y calidad observados en día 5-6, de acuerdo a calidad y desarrollo en día 2 y 3. Para este análisis, se consideraron las siguientes categorías de cada estadío:

  • blastocistos en día 5-6: 4BB o mejor en día 5; 3BB o mejor en día 5; 3BB o mejor en día 6; otros blastocistos en día 5-6; embriones detenidos.
  • Embriones en día 3: 8 o más células y buena calidad, mononucleados en día 2; 8 o más células y buena calidad, sin núcleos visibles en día 2; 6 y 7 células y buena calidad; 6 o más células y calidad regular; 6 o más células y mala calidad; menos de 6 células y mala calidad.

Relación entre morfología en días 2 y 3 e Implantación de blastocistos. Se analizaron las tasas de implantación de acuerdo a:

  • desarrollo y calidad de blastocistos: 4BB o mejor vs. calidad menor que 4BB, y
  • calidad embrionaria en día 2-3: buenos embriones (8 o más células, buena calidad en día 3 y mononucleados en día 2), vs embriones regulares (6 o más células, buena calidad en día 3 y no multinucleados en día 2), vs. embriones de mala calidad.

Los embarazos gemelares se computaron como un blastocisto implantado.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó mediante Chi-cuadrado y Chi-cuadrado para tendencias. Un p<0.05 se consideró estadísticamente significativo.

 

RESULTADOS

Relación entre parámetros morfológicos individuales de días 2 y 3 y de blastocistos.

La figura 1 muestra la relación entre el desarrollo alcanzado en día 5 por 1944 embriones y parámetros embrionarios tempranos individuales. La proporción de embriones detenidos fue significativamente mayor en embriones de mal pronóstico: multinucleados en día 2 (1A), de menos de 6 células en día 3 (1B), y de mala calidad en día 3 (1C). De manera opuesta, el desarrollo hasta blastocisto expandido en día 5 fue significativamente mayor en embriones de buen pronóstico: mononucleados en día 2 (1A), de 8 o más células en día 3 (1B), y de buena calidad en día 3 (1C).


Figura 1. Desarrollo hasta día 5 de 1944 embriones.  Distribución de acuerdo a: (1A) núcleos visibles en las blastómeras en día 2, (1B) número de blastómeras en día 3, y (1C) calidad embrionaria en día 3. 
(*) p˂0.0001 entre los grupos.
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La figura 2 muestra la relación entre la morfología de MCI-TE de 1111 blastocistos de día 5 y 6 y parámetros embrionarios tempranos individuales. Los embriones con parámetros de mal pronóstico (multinucleados en día 2, 2A; de menos de 6 células en día 3, 2B; o de mala morfología en día 3, 2C), obtuvieron una mayor proporción blastocistos de mala morfología. De manera opuesta, los embriones con parámetros de buen pronóstico (mononucleados en día 2, 2A; de 8 o más células en día 3, 2B; y de buena calidad en día 3, 2C) lograron mayor proporción de blastocistos de buena morfología.


Figura 2. Morfología de MCI-TE de 1111 blastocistos en día 5-6. 
Distribución de acuerdo a: (1A) núcleos visibles en las blastómeras en día 2, (1B) número de blastómeras en día 3, y (1C) calidad embrionaria en día 3. (†) p=0.0009 entre los grupos (*) p˂0.0001 entre los grupos

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Relación entre parámetros morfológicos agrupados de días 2 y 3 y de blastocistos.

 Al analizar la información combinada de nucleación en día 2 y morfología y desarrollo en día 3, versus desarrollo y morfología combinados en día 5-6, encontramos una relación significativa entre lo observado en estadios de clivaje y los blastocistos obtenidos. La mejor morfología de días 2-3 logró 68% de blastocistos de buena calidad, mientras que la peor morfología de días 2-3 tuvo una tasa de embriones detenidos de 62%. (Figura 3)


Figura 3. Desarrollo y calidad de blastocistos en día 5-6 de 1565 embriones no multinucleados en día 2. Distribución de acuerdo calidad y desarrollo en día 3.  p˂0.0001 entre los grupos.
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Relación entre morfología en días 2 y 3 e Implantación de blastocistos.

La tabla 1 muestra los resultados de implantación de acuerdo a la calidad de los blastocistos en día 5 y lo observado previamente en días 2 y 3.

La calidad embrionaria temprana mostró correlación con la calidad de blastocistos: de los 123 embriones de buena calidad, 91 (74%) fueron blastocistos de buena calidad; de los 73 embriones regulares, 38 (55%), y de los 81 embriones de mala calidad, solo 27 (33%). (p<0.0001)

La tasa de implantación fue significativamente diferente de acuerdo a la calidad embrionaria en días 2 y 3: 55%, 51% y 40% para embriones de calidad buena, regular y mala (p=0.0303, Chi-cuadrado para tendencias).

Del mismo modo, los blastocistos de mejor calidad tuvieron una implantación significativamente mayor que los de menor calidad (63% vs 32%; p<0.0001)

La calidad embrionaria en días 2-3, al evaluarse en cada grupo de calidad de blastocistos, no permitió distinguir una mejor o peor implantación. La implantación de acuerdo a calidad embrionaria buena, regular o mala fue: en ≥4BB: 63%, 63%, 63% (no significativo); y en <4BB: 34%, 37%, 28% (no significativo).


Tabla 1. Tasa de implantación de acuerdo a la calidad del blastocisto transferido en día 5 y a la calidad embrionaria en días 2 y 3. (*) y (†) NS entre los grupos, (‡) p=0.0303 entre los grupos, (¶) p<0.0001 entre los grupos.
  blastocisto
4BB o mejor
blastocisto
peor que 4BB

Total

Calidad embrionaria d2-3

EC

TR IR EC TR IR EC TR

IR

                   
    Buena calidad

57

91 63%* 11 32 34%† 68 123

55%‡

    Calidad regular

24

38 63%* 13 35 37%† 37 73 51%‡
    Mala calidad 17 27 63%* 15 54 28%† 32 81 40%‡
Total 98 156 63% 39 121 32%¶ 137 277

49%

DISCUSION

 La introducción de cultivo a blastocisto planteó nuevos interrogantes a la evaluación embrionaria temprana: los criterios de evaluación temprana predicen la formación de blastocistos, (8,30,31) pero no superan las decisiones de selección que pueden tomarse en día 5. Graham y cols concluyeron que solo la mitad de los embriones seleccionados en día 3 para transferir o criopreservar hubieran sido seleccionados en estado de blastocisto. (32)

En los trabajos publicados, la consideración conjunta de parámetros tempranos y de día 5 no ha dado el resultado esperado. Para Guerif y cols, si bien la morfología de día 1 y 2 permitió predecir el desarrollo a blastocisto, luego de la transferencia de éstos no encontraron relación entre morfología temprana e implantación. (27,28) Herbemont y cols no encontraron relación entre la morfología de día 2 o de día 3 y el desarrollo de los blastocistos transferidos o su implantación. (29)

En nuestro trabajo, el análisis de la relación entre morfología temprana y blastocistos se realizó sobre el total de embriones disponibles en día 2, y no sobre el total de blastocistos transferidos. Los resultados sugieren que la mayor contribución de la morfología temprana radica en distinguir aquellos embriones con alta probabilidad de detención de su desarrollo.

Los parámetros morfológicos de día 2 y 3 que seleccionamos (nucleación en día 2 y número de células y morfología en día 3) tuvieron individualmente la capacidad de predecir significativamente el desarrollo hasta blastocisto y su calidad morfológica. A mejor morfología en día 2 y 3, menos detención en cultivo, mayor expansión y mejor calidad de blastocistos.

La consideración de estos parámetros de día 2 y 3 agrupados también pudo predecir significativamente el desarrollo y calidad en día 5-6.

Sin embargo se debe reconocer que esta capacidad de predicción fue limitada: de los embriones juzgados como mejores en día 2 y 3, el 15% se detuvo en día 5 y solo un 50% fue considerado el mejor blastocisto disponible.

Esto mismo se evidencia en los resultados de parámetros individuales: la mayoría de los embriones con parámetros de mal pronóstico se detuvieron en cultivo. Pero en cada uno de estos grupos hubo embriones capaces de superar con éxito la activación del genoma embrionario para “corregir” sus errores metabólicos y desarrollarse hasta blastocisto.

Al analizar la implantación de los blastocistos transferidos, la calidad de día 5 utilizada para seleccionarlos al momento de la transferencia, fue capaz de predecir la implantación, teniendo los mejores blastocistos el doble de implantación respecto al grupo de menor calidad. La calidad embrionaria temprana de los blastocistos transferidos, analizada retrospectivamente, correlacionó con la proporción de blastocistos de buena calidad obtenidos y con la tasa de implantación.

La pregunta que subyace al diseño de este trabajo, y a los de Guerif y Herbemont, (27,28,29) es evidente: ¿es comparable la viabilidad de blastocistos de calidad semejante si provienen de embriones de diferente morfología temprana?

Nuestros resultados muestran que el valor de la morfología de blastocistos para predecir implantación no mejoró al considerar la calidad embrionaria en días 2 y 3.

La calidad embrionaria temprana, entonces, permite distinguir qué proporción de embriones va a desarrollar un blastocisto de buen pronóstico, pero una vez logrado éste, no agrega información sobre su implantación.

Esta conclusión permite replantear la selección embrionaria en base a la morfología cuando se cultiva hasta blastocisto: evaluar en días 2 y 3 no es necesario. Teniendo en cuenta que la evaluación del embrión se realiza retirando diariamente los mismos de las incubadoras, y que esto afecta la estabilidad de la condición de cultivo, estaríamos provocando un estrés innecesario a los embriones. El cultivo individual carece también de sentido, ya que no se requiere seleccionar el “top embryo” acumulando criterios de viabilidad de diferentes estadios. (9-10) Si esta ventaja del cultivo individual ya no es necesaria, es preferible optar por un cultivo grupal con las ventajas de interacción que se han demostrado cuando se cultiva hasta día 5. (31,32)

El cultivo y selección embrionaria hasta día 5 debería entonces basarse, sin riesgo a perder información, en cultivo grupal de ovocitos fertilizados desde el día 1, con la menor cantidad de interrupciones hasta su evaluación el día de la transferencia o criopreservación.

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